ПЦР, гэта палімеразная ланцуговая рэакцыя, якая адносіцца да дадання dNTP, Mg2+, фактараў элангацыі і фактараў узмацнення ампліфікацыі ў сістэму пры каталізе ДНК-палімеразы з выкарыстаннем бацькоўскай ДНК у якасці шаблону і спецыфічных праймераў у якасці адпраўной кропкі пашырэння, З дапамогай этапаў дэнатурацыі, адпалу, падаўжэння і г.д. працэс рэплікацыі даччынай ланцуга ДНК in vitro, камплементарнай матрычнай ДНК бацькоўскага ланцуга, можа хутка і спецыфічна ўзмацніць любую мэтавую ДНК in vitro.
1. ПЦР з гарачым стартам
Час пачатку ампліфікацыі ў звычайнай ПЦР - гэта не тое, каб паставіць ПЦР-апарат у ПЦР-апарат, пасля чаго праграма пачынае ампліфікацыю.Калі канфігурацыя сістэмы завершана, пачынаецца ампліфікацыя, якая можа выклікаць неспецыфічную ампліфікацыю, і ПЦР з гарачым пускам можа вырашыць гэтую праблему.
Што такое ПЦР з гарачым стартам?Пасля падрыхтоўкі рэакцыйнай сістэмы мадыфікатар фермента вызваляецца пры высокай тэмпературы (звычайна вышэй за 90°C) падчас пачатковай стадыі нагрэву рэакцыі або стадыі «гарачага старту», так што ДНК-палімераза актывуецца.Дакладны час актывацыі і тэмпература залежаць ад прыроды ДНК-палімеразы і мадыфікатара гарачага старту.У гэтым метадзе ў асноўным выкарыстоўваюцца такія мадыфікатары, як антыцелы, афінныя ліганды або хімічныя мадыфікатары для інгібіравання актыўнасці ДНК-палімеразы.Паколькі актыўнасць ДНК-палімеразы інгібіруецца пры пакаёвай тэмпературы, тэхналогія гарачага старту забяспечвае вялікую зручнасць для падрыхтоўкі некалькіх рэакцыйных сістэм ПЦР пры пакаёвай тэмпературы без шкоды для спецыфічнасці рэакцый ПЦР.
2. ОТ-ПЦР
RT-PCR (ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй) - гэта эксперыментальны метад зваротнай транскрыпцыі з мРНК у кДНК і яе выкарыстання ў якасці шаблону для ампліфікацыі.Эксперыментальная працэдура заключаецца ў экстракцыі агульнай РНК у тканінах або клетках, выкарыстанні Oligo (dT) у якасці праймера, выкарыстанні зваротнай транскрыптазы для сінтэзу кДНК, а затым выкарыстанні кДНК у якасці матрыцы для ПЦР-ампліфікацыі для атрымання гена-мішэні або выяўлення экспрэсіі гена.
3. Флуоресцентная колькасная ПЦР
Флуарэсцэнтная колькасная ПЦР (колькасная ПЦР у рэальным часе,RT-кПЦР) адносіцца да метаду дадання флуоресцентных груп у рэакцыйную сістэму ПЦР, выкарыстання назапашвання флуоресцентных сігналаў для маніторынгу ўсяго працэсу ПЦР у рэжыме рэальнага часу і, нарэшце, выкарыстання стандартнай крывой для колькаснага аналізу шаблону.Часта выкарыстоўваюцца метады qPCR ўключаюць SYBR Green I і TaqMan.
4. Гнездавая ПЦР
Укладзеная ПЦР адносіцца да выкарыстання двух набораў ПЦР-праймераў для двух раундаў ПЦР-ампліфікацыі, а прадуктам ампліфікацыі другога раунда з'яўляецца мэтавы фрагмент гена.
Калі неадпаведнасць першай пары праймераў (вонкавых праймераў) выклікае ампліфікацыю неспецыфічнага прадукту, верагоднасць таго, што той жа неспецыфічны ўчастак будзе распазнаны другой парай праймераў і працягне ампліфікацыю, вельмі малая, таму ампліфікацыі па другой пары праймераў, палепшана спецыфічнасць ПЦР.Адной з пераваг выканання двух раундаў ПЦР з'яўляецца тое, што гэта дапамагае ўзмацніць дастатковую колькасць прадукту з абмежаванай зыходнай ДНК.
5. Тачдаун ПЦР
Тачдаун ПЦР - гэта метад павышэння спецыфічнасці ПЦР-рэакцыі шляхам рэгулявання параметраў цыкла ПЦР.
Пры прызямленні ПЦР тэмпература адпалу для першых некалькіх цыклаў усталёўваецца на некалькі градусаў вышэй максімальнай тэмпературы адпалу (Tm) праймераў.Больш высокая тэмпература адпалу можа эфектыўна паменшыць неспецыфічную ампліфікацыю, але ў той жа час больш высокая тэмпература адпалу пагоршыць падзел праймераў і паслядоўнасцей-мішэняў, што прывядзе да зніжэння выхаду ПЦР.Такім чынам, у першыя некалькі цыклаў тэмпература адпалу звычайна зніжаецца на 1°C за цыкл, каб павялічыць утрыманне мэтавага гена ў сістэме.Пры паніжэнні тэмпературы адпалу да аптымальнай тэмпература адпалу падтрымліваецца на працягу астатніх цыклаў.
6. Прамая ПЦР
Прамая ПЦР адносіцца да ампліфікацыі ДНК-мішэні непасрэдна з узору без неабходнасці выдзялення і ачысткі нуклеінавай кіслаты.
Існуе два выгляду прамой ПЦР:
прамы метад: вазьміце невялікую колькасць пробы і дадайце яе непасрэдна ў PCR Master Mix для ПЦР-ідэнтыфікацыі;
метад крэкінгу: пасля ўзяцця пробы дадайце яе ў лізат, лізуйце для вызвалення геному, вазьміце невялікую колькасць лізаванага супернатанту і дадайце яго ў PCR Master Mix, правядзіце ПЦР-ідэнтыфікацыю.Такі падыход спрашчае эксперыментальны працоўны працэс, скарачае практычны час і дазваляе пазбегнуць страты ДНК падчас этапаў ачысткі.
7. СОЭ ПЦР
ПЦР пры зрошчванні генаў шляхам перакрыцця (SOE PCR) выкарыстоўвае праймеры з камплементарнымі канцамі, каб прадукты ПЦР утваралі перакрываючыяся ланцужкі, так што ў наступнай рэакцыі ампліфікацыі праз падаўжэнне перакрываючыхся ланцугоў розныя крыніцы метаду А, у якім ампліфікаваныя фрагменты перакрываюцца і злучаныя разам.Гэтая тэхналогія ў цяперашні час мае два асноўных напрамкі прымянення: канструяванне злітых генаў;сайт-накіраваная мутацыя гена.
8. IPCR
Зваротная ПЦР (IPCR) выкарыстоўвае зваротныя камплементарныя праймеры для ампліфікацыі фрагментаў ДНК, акрамя двух праймераў, і ўзмацняе невядомыя паслядоўнасці з абодвух бакоў вядомага фрагмента ДНК.
IPCR першапачаткова быў распрацаваны для вызначэння паслядоўнасці суседніх невядомых абласцей і ў асноўным выкарыстоўваецца для вывучэння паслядоўнасцей промотора генаў;онкогенные храмасомныя перабудовы, такія як зліццё генаў, транслокация і транспазіцыя;і інтэграцыі вірусных генаў, таксама часта выкарыстоўваюцца ў цяперашні час. Для накіраванага мутагенезу скапіруйце плазміду з патрэбнай мутацыяй.
9. дПЦР
Лічбавая ПЦР (dPCR) - гэта метад абсалютнага колькаснага вызначэння малекул нуклеінавых кіслот.
У цяперашні час існуе тры метаду колькаснага вызначэння малекул нуклеінавых кіслот.Фотаметрыя заснавана на паглынанні малекул нуклеінавых кіслот;колькасная флуарэсцэнтная ПЦР у рэальным часе (ПЦР у рэальным часе) заснавана на значэнні Ct, а значэнне Ct адносіцца да колькасці цыклаў, якія адпавядаюць значэнню флуарэсцэнцыі, якое можа быць выяўлена;лічбавая ПЦР - гэта найноўшая колькасная тэхналогія, заснаваная на метадзе ПЦР адной малекулы для падліку нуклеінавых кіслот. Колькасная ацэнка - гэта абсалютны колькасны метад.
Час публікацыі: 13 чэрвеня 2023 г