Выкарыстанне і меры засцярогі ультрафільтрацыйнай цэнтрыфужнай прабіркі
1) Выберыце прыдатную трубку для ультрафільтрацыі.Звярніце ўвагу, што УФ мембраны адрозніваюцца па ўзроўні ўстойлівасці да розных хімічных рэчываў.Як правіла, ультрафільтрацыйныя трубкі з адсячэннем малекулярнай масы 10 кДа могуць быць выбраны з адсячэннем малекулярнай масы, якая не павінна перавышаць 1/3 малекулярнай масы цікавага бялку, напрыклад, 35 кДа.Калі малекулярная маса цікавага бялку складае каля 10 кДа, можна выкарыстоўваць трубку для ультрафільтрацыі з гранічнай малекулярнай масай 3 кДа.
(2) Ультрафільтрацыя, толькі што набытая, з'яўляецца сухой, з даданнем звышчыстай вады перад выкарыстаннем і вадой, цалкам прапушчанай праз мембрану, ледзяную ванну або халадзільнік, папярэдне астуджаную на працягу некалькіх хвілін.Затым ваду зліваюць, г.зн. бялковую вадкасць, і колькі дадаецца, у залежнасці ад таго, што не перавышае белую лінію ў верхняй частцы трубкі.Аперацыя лёгкая, і ультрафільтрацыйную трубку неабходна папярэдне астудзіць на лёдзе перад даданнем бялковага раствора.
3) І маса, і цэнтр цяжару павінны былі дасягнуць раўнавагі.Звярніце ўвагу, што хуткасць кручэння і паскарэнне не вельмі хуткія, у адваротным выпадку непасрэднае пашкоджанне ультрафільтрацыйнай мембраны.Пачатак цэнтрабежнай ультрафільтрацыі (цэнтрыфуга папярэдне астуджаная да 4 градусаў).Пасля пераўтварэння абаротаў у хвіліну розных цэнтрыфуг у г яны былі рознымі.Паскарэнне цэнтрыфугі давялі да мінімуму, знізіўшы ціск на мембрану.Звярніце ўвагу, не забудзьцеся пакінуць цэнтрыфугу пасля таго, як цэнтрыфуга дасягнула мэтавай хуткасці, або калі ў вас узнікла праблема, вы не можаце справіцца з ёй у першы раз.Арыентацыя мембраны да шпіндзеля была адрэгулявана ў адпаведнасці з інструкцыяй (вуглавы корпус цэнтрыфугі мембрана перпендыкулярна восі).Пры практычным выкарыстанні агульная хуткасць кручэння ніжэй, чым у інструкцыі, так што тэрмін службы цэнтрыфужнай прабіркі можа быць падоўжаны.
3) І маса, і цэнтр цяжару павінны былі дасягнуць раўнавагі.Звярніце ўвагу, што хуткасць кручэння і паскарэнне не вельмі хуткія, у адваротным выпадку непасрэднае пашкоджанне ультрафільтрацыйнай мембраны.Пачатак цэнтрабежнай ультрафільтрацыі (цэнтрыфуга папярэдне астуджаная да 4 градусаў).Пасля пераўтварэння абаротаў у хвіліну розных цэнтрыфуг у г яны былі рознымі.Паскарэнне цэнтрыфугі давялі да мінімуму, знізіўшы ціск на мембрану.Звярніце ўвагу, не забудзьцеся пакінуць цэнтрыфугу пасля таго, як цэнтрыфуга дасягнула мэтавай хуткасці, або калі ў вас узнікла праблема, вы не можаце справіцца з ёй у першы раз.Арыентацыя мембраны да шпіндзеля была адрэгулявана ў адпаведнасці з інструкцыяй (вуглавы корпус цэнтрыфугі мембрана перпендыкулярна восі).Пры практычным выкарыстанні агульная хуткасць кручэння ніжэй, чым у інструкцыі, так што тэрмін службы цэнтрыфужнай прабіркі можа быць падоўжаны.
(4) Пасля канцэнтрацыі да астатняга 1 мл вазьміце 50 мкл буфернага раствора, дадайце 10 мкл праточнага раствора і паглядзіце, ці ёсць сіні колер, каб вызначыць, ці адсутнічае бялок у ультрафільтрацыйнай трубцы.Калі трубка негерметычная, паўторна наліце верхні пласт і працячыце ў новую трубку, каб пачаць ультрафільтрацыю.Каб дакладна вызначыць, ці былі прапушчаны прабіркі, адцэнтрыфугуйце на працягу 10 хвілін з 5 мг мл БСА перад прапусканнем, працуючы на бялковым клеі або аналізе Брэдфарда, і працягвайце, дадаючы пакінуты канцэнтраваны бялковы раствор (які працуе на лёдзе і прадухіляе награванне бялкоў), пакуль ўвесь канцэнтрат быў дададзены.Будзьце асцярожныя падчас цэнтрыфугавання, калі адбываецца выпадзенне бялкоў у асадак, што прывядзе да закрыцця прабіркі.Пры выпадзенні асадка вызначце, ці з'яўляецца канкрэтнай прычынай выпадзення празмерная канцэнтрацыя бялку або неадпаведны буфер;Першы можна вырашыць шляхам ультрафільтрацыі ў некалькіх ультрафільтрацыйных прабірках адначасова, зніжаючы канцэнтрацыю, а другі - шляхам абмену рознымі буфернымі растворамі, пакуль бялок не выпадзе ў асадак.
(4) Пасля канцэнтрацыі да астатняга 1 мл вазьміце 50 мкл буфернага раствора, дадайце 10 мкл праточнага раствора і паглядзіце, ці ёсць сіні колер, каб вызначыць, ці адсутнічае бялок у ультрафільтрацыйнай трубцы.Калі трубка негерметычная, паўторна наліце верхні пласт і працячыце ў новую трубку, каб пачаць ультрафільтрацыю.Каб дакладна вызначыць, ці былі прапушчаны прабіркі, адцэнтрыфугуйце на працягу 10 хвілін з 5 мг мл БСА перад прапусканнем, працуючы на бялковым клеі або аналізе Брэдфарда, і працягвайце, дадаючы пакінуты канцэнтраваны бялковы раствор (які працуе на лёдзе і прадухіляе награванне бялкоў), пакуль ўвесь канцэнтрат быў дададзены.Будзьце асцярожныя падчас цэнтрыфугавання, калі адбываецца выпадзенне бялкоў у асадак, што прывядзе да закрыцця прабіркі.Пры выпадзенні асадка вызначце, ці з'яўляецца канкрэтнай прычынай выпадзення празмерная канцэнтрацыя бялку або неадпаведны буфер;Першы можна вырашыць шляхам ультрафільтрацыі ў некалькіх ультрафільтрацыйных прабірках адначасова, зніжаючы канцэнтрацыю, а другі - шляхам абмену рознымі буфернымі растворамі, пакуль бялок не выпадзе ў асадак.
(5) Першыя некалькі этапаў выкарыстоўваюцца для канцэнтрацыі бялку, і калі буфер трэба змяніць, акуратна дадайце новы буфер (ультрафільтрацыя праз ультрафільтрацыйную мембрану 0,22 мкм) прыкладна да 1 мл агульнага бялку і паўторна канцэнтруйце прыкладна да 1 мл на працягу трох раз запар, з канчатковым канцэнтраваным канчатковым аб'ёмам у залежнасці ад патрэбнай канцэнтрацыі бялку, як правіла, не больш за 500 мкл, але таксама з дакладнасцю да 200 мкл.Дасягнуць 1000 × або больш у трох выпадках, па сутнасці столькі ж змянення буфера, як разлічана па меншай меры 10 × ці каля таго аб'ёмнага ўзбагачэння кожны раз.
(5) Першыя некалькі этапаў выкарыстоўваюцца для канцэнтрацыі бялку, і калі буфер трэба змяніць, акуратна дадайце новы буфер (ультрафільтрацыя праз ультрафільтрацыйную мембрану 0,22 мкм) прыкладна да 1 мл агульнага бялку і паўторна канцэнтруйце прыкладна да 1 мл на працягу трох раз запар, з канчатковым канцэнтраваным канчатковым аб'ёмам у залежнасці ад жаданай канцэнтрацыі бялку, як правіла, не больш за 500 мкл, але таксама з дакладнасцю да 200 мкл.Дасягнуць 1000 × або больш у трох выпадках, па сутнасці, столькі ж змянення буфера, як разлічана прынамсі 10 × або каля таго аб'ёмнага ўзбагачэння кожны раз.
Час публікацыі: 9 лістапада 2022 г